Dear all,<br><br>I am a relative newbie to AUC, but am interested in generating a global analysis of SV titration data to get an estimate of the Kd and cooperativity of my system.  I have an RNA-binding protein that runs at 4.4S and binds to a 20bp dsRNA of 2.6S.  I've done a titration of 1uM dsRNA with increasing amounts of protein, spun at 45K rpm and monitored at 260 and 280nm (and IF, but was very noisy).  I estimated that the Kd was ~< 1uM based on EMSA results.  I kept the RNA concentration constant near the estimated Kd since the A260 would get too high otherwise. Attached is an overlay of the resulting c(s) (from 260nm data).  You can see the 2.6S RNA peak decrease as protein is added with a  5-6S (concentration-dependent) species appearing as well as a 7.8S species (whose position remains pretty constant over the concentration range tested).  The concentration dependent S-value first increases from 5.7 to ~6S, then decreases as more protein is added.  I interpret this as a "fast" kinetic reaction (koff>10^-4) of a 1:1 complex and a "slow" dissociating 2:1 complex (protein:RNA).  Is that a reasonable interpretation?  I'd thought to use Gilbert-Jenkins Sfast/Sundisturbed and Pop-fast/Pop-undist. isotherms to analyze the data, but couldn't find anything in the literature for a 2:1 complex.  Is GJ approach valid/feasible for anything more than 1:1 system? 
I'd like to generate isotherms from this data to fit with sedphat in a A+B-->AB+B-->ABB model.<br><br>Also, I tried doing a multi-signal SV analysis to get the stoichiometry of the 7.8S complex (280 and 260nm), and it roughly works (1.75:1, have to better refine extinction coefficients-protein alone was only estimated), but the c280(s) and c260(s) peaks were separated by ~0.7S for the region of the complex (7.4S and 8.1S see other attached figure).  I was thinking this might have to do with the rate of data aquisition for each scan (older machine with 3 cells being scanned at 280nm and 260nm, so 260nm scan is some minutes after 280nm).  In all, there were only 15-16 scans in which the fast boundary was observed so maybe that has an effect too.<br>
<br>Finally, if I do a multi-signal SV analysis on each concentration point to get an estimate of each species in the concentration-dependent reaction boundary, the free/undisturbed species and the final complex, could I generate isotherms with that to analyze with the  A+B-->AB+B-->ABB model?<br>
<br>Any advice or help would be appreciated, even if it's just to be told I'm a raving lunatic for attempting this.<br><br>Thanks,<br>Ian<br><br><br>