<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD HTML 4.01 Transitional//EN">

<html>

<head>

  <meta http-equiv="Content-Type" content="text/html;charset=ISO-8859-1">

  <title></title>

</head>

<body text="#000000" bgcolor="#ffffff">

Dear  RASMBers, <br>

<br>

I have a question concerning Satinder's results. Satinder, you

mentioned that sigma increased with concentration and with rotor speed.

For a reversibly homo-associating system I thought that the sigma would

remain constant with speed (assuming all data between the meniscus to

the bottom can used in the fitting) whereas for a heterogeneous system

the sigma would actually decrease as a function of increasing speed.

What causes the increase in sigma with rotor speed?   I realize that

one should not put too much stock in these diagnostic graphs (sigma vs

speed and/or conc) but I just want to make sure that I am thinking

about it correctly so if someone could set me straight on this issue I

would greatly appreciate it.<br>

<br>

Regards, <br>

Tim<br>

<a class="moz-txt-link-abbreviated" href="mailto:rasmb-request@server1.bbri.org">rasmb-request@server1.bbri.org</a> wrote: f<br>

<blockquote type="cite"

 cite="mid200411051701.iA5H11308571@server1.bbri.org">

  <pre wrap="">Send RASMB mailing list submissions to

        <a class="moz-txt-link-abbreviated" href="mailto:rasmb@rasmb-email.bbri.org">rasmb@rasmb-email.bbri.org</a>

To subscribe or unsubscribe via the World Wide Web, visit

        <a class="moz-txt-link-freetext" href="http://rasmb-email.bbri.org/mailman/listinfo/rasmb">http://rasmb-email.bbri.org/mailman/listinfo/rasmb</a>

or, via email, send a message with subject or body 'help' to

        <a class="moz-txt-link-abbreviated" href="mailto:rasmb-request@rasmb-email.bbri.org">rasmb-request@rasmb-email.bbri.org</a>

You can reach the person managing the list at

        <a class="moz-txt-link-abbreviated" href="mailto:rasmb-admin@rasmb-email.bbri.org">rasmb-admin@rasmb-email.bbri.org</a>

When replying, please edit your Subject line so it is more specific

than "Re: Contents of RASMB digest..."

----------------------------------------------------------------------------------

The older archived RASMB emails can be found at:

<a class="moz-txt-link-freetext" href="http://rasmb-email.bbri.org/rasmb_archives">http://rasmb-email.bbri.org/rasmb_archives</a>

and current archives at

<a class="moz-txt-link-freetext" href="http://rasmb-email.bbri.org/pipermail/rasmb/">http://rasmb-email.bbri.org/pipermail/rasmb/</a>

Search All the Archives at:

<a class="moz-txt-link-freetext" href="http://rasmb-email.bbri.org/rasmb_search.html">http://rasmb-email.bbri.org/rasmb_search.html</a>

----------------------------------------------------------------------------------

Today's Topics:

   1. question about WinNONLIN (Satinder Singh)

   2. Re: question about WinNONLIN (Peter Schuck)

--__--__--

Message: 1

Date: Thu, 4 Nov 2004 12:06:39 -0500 (EST)

From: Satinder Singh <a class="moz-txt-link-rfc2396E" href="mailto:ss2337@columbia.edu"><ss2337@columbia.edu></a>

To: <a class="moz-txt-link-abbreviated" href="mailto:rasmb@server1.bbri.org">rasmb@server1.bbri.org</a>

Subject: [RASMB] question about WinNONLIN

Hello.

I am trying to determine the dissociation constant of a homodimer. The 

monomer molecular weight (by both sequence & molecular weight) is 33,400 

Da. At 15,000 rpm, the sigma is 0.95. I ran the experiment at 15,000, 

20,000, 27,000, and 35,000 rpm with 4 different protein concentrations 

(0.2, 0.4, 0.8, & 1.2 mg/ml) using A280 detection.

Before concluding that I indeed had a monomer-dimer equilibrium, I used 

the "sigma test" to see if there was evidence of association. Indeed, the 

sigma increased as a function of protein concentration (for a single

rotor speed). It also increased as a function of rpm (for a single protein

concentration).

The data are best fit to a monomer-dimer equilibrium, although the 

residuals with this model (sigma fixed) still look a bit skewed. The SRV, 

however, is pretty good at 5.6384x10-3. The question I have is 

this: When I FIX sigma at the monomer molecular weight, I get a 

dissociation constant of 12 uM. However, if I let sigma float, sigma falls 

to 0.8276, which corresponds to a molecular weight of 28,000 Da,  and I 

get a dissociation constant of 2.3 uM.

If the data are fitted correctly and nothing has happened to the protein

sample during the experiment, i.e., aggregation, precipitation, shouldn't

the 2 dissociation constants be relatively close? Could anyone tell me 

what I may be doing wrong?

Thanks in advance for your help.

Satinder

--__--__--

Message: 2

Date: Thu, 04 Nov 2004 13:14:01 -0500

To: Satinder Singh <a class="moz-txt-link-rfc2396E" href="mailto:ss2337@columbia.edu"><ss2337@columbia.edu></a>

From: Peter Schuck <a class="moz-txt-link-rfc2396E" href="mailto:pschuck@helix.nih.gov"><pschuck@helix.nih.gov></a>

Subject: Re: [RASMB] question about WinNONLIN

Cc: <a class="moz-txt-link-abbreviated" href="mailto:rasmb@server1.bbri.org">rasmb@server1.bbri.org</a>

Hi Satinder,

there's probably several possibilities, but it reminds me of a protein we 

studied when there was a bit of low molecular weight impurities in the 

prep.  Sometimes, these can go undetected on SDS PAGE, but would skew the 

sedimentation profiles in a way consistent to what you describe.  I would 

try a model fixing the molecular weight (and v-bar - I assume that's 

known), floating the binding constant, and adding an unrelated species of 

fixed molar mass (low Mw, perhaps a few kDa) into the global fit to see if 

that can explain the data.  (I'm not sure if WinNONLIN let's you do this, 

I'm using SEDPHAT.)  In order to verify this, if you still have the sample, 

it might be useful to do a velocity run (after shaking up the sample, that 

should work well enough even with a few mm column).  In our case, we saw 

the same species in a very slow boundary in a velocity experiment done in 

parallel.

Hope that helps,

Peter

At 12:06 PM 11/4/2004 -0500, you wrote:

  </pre>

  <blockquote type="cite">

    <pre wrap="">----------------------------------------------------------------------------------